Logan / Wolverine (Hugh Jackman) – Um dos mutantes mais carismáticos do Universo X-Men que apesar da sua rude personalidade, assume constantemente uma atitude heróica. Esta obra recupera o passado desta enigmática personagem que foi vítima de várias experiencias macabras que o transformaram no poderoso mutante que é hoje. Aos seus poderes de regeneração, junta-se um esqueleto completamente coberto por Adamantium, o metal mais resistente do Planeta. Wolverine jurou vingar-se da Weapon X, a organização responsável por essa transformação que ele nunca quis.
William Stryker (Danny Huston) – Um fundamentalista religioso que pretende aniquilar a raça mutante que considera impura e perigosa. Este humano responsabiliza os mutantes pelo seu trágico passado e vê nos seus poderes uma força destruidora que tem de ser travada a todo o custo. Stryker é o director e comandante supremo da temível organização criminosa Weapon X, responsável por inúmeras atrocidades e perigosas experiências contra mutantes, nomeadamente contra Wolverine. O seu objectivo é criar uma máquina de destruição praticamente perfeita que possa controlar e que consiga destruir todos os mutantes do Planeta.
Victor Creed / Sabretooth (Liev Schreiber) – O meio-irmão de Wolverine que curiosamente é o seu maior rival. Apesar dos estreitos laços familiares que os unem, estes dois meios-irmãos encontram-se quase sempre em lados opostos da barricada e quando se encontram o desfecho é quase sempre uma fervorosa luta. Tal como o seu meio-irmão e principal inimigo, Sabretooth é um poderoso mutante que alia a sua capacidade de regeneração à sua personalidade selvagem e força sobre-humana. Também fez parte das experiencias da Weapon X mas ao contrário do seu meio-irmão, decidiu permanecer no projecto.
Remy LeBeau / Gambit (Taylor Kitsch) – Um talentoso ladrão e astuto jogador que é dotado duma habilidade mutante invulgar mas perigosa. Gambit é capaz de energizar qualquer objecto que posteriormente explode, causando danos proporcionais ao seu tamanho. Dentro do Universo X-Men, Gambit é uma das personagens mais apreciadas pelos fãs.
John Wraith (Will.I.Am) – Um ágil mutante teletransportador que trabalha para a Weapon X. Os seus poderes e personalidade assemelham-se bastante aos de Nightcrawler.
David North / Agent Zero (Daniel Henney) – Um dos mais importantes membros da Weapon X. Um experiente soldado com uma excelente pontaria que é especialista em seguir rastos e decifrar enigmas.
Wade Wilson / Deadpool (Ryan Reynolds) – Um imprudente mercenário mutante que tal como Wolverine, consegue regenerar-se e curar-se automaticamente.
Weapon XI (Scott Adkins) – A derradeira máquina de carnificina da Weapon X que aproveita os poderes dos mais poderosos mutantes do Planeta para destruir a concorrência. É um dos principais vilões do filme.
Kayla Silver Fox (Lynn Collins) – Esta humana representa o verdadeiro interesse romântico de Wolverine e a sua grande fraqueza emocional.